細胞凍存袋方法

1、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。

2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

3、沉淀加含保護液的培養(yǎng)，計數(shù)，調整至5×106/ml左右。

4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。

5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂。

6、貼上標簽，CS250凍存袋批發(fā)，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。

7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘)→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱(－30℃ 1小時）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。

注意：操作時應小心，以免液氮。液氮定期檢查，CS50凍存袋批發(fā)，隨時補充，不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

細胞凍存復蘇方法

1.  細胞實驗室進行常規(guī)消毒，北京凍存袋批發(fā)，紫外照射40min以上。

2.  培養(yǎng)液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱37°C預熱20min，備用。

3.  二亞砜（DMSO)在40°C冰箱中冷藏30min，備用。

4.  從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400°C水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。

5.  將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）。

6.  用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，方培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7.  記錄復蘇日期。

凍存袋注意事項

1.欲冷凍保存之細胞應在生長良好且存活率高之狀態(tài)，約為80~90%致密度。

冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有antibody之產(chǎn)生。

2.細胞在液氮中可長期凍存沒有時間限制，而不會影響細胞活力﹔在-70度可保存數(shù)月。注意冷凍保護劑之品質。

DMSO應為***級等級，無菌且無色是直接購買無菌產(chǎn)品，以5~10m1小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。

3.凍存細胞數(shù)量要足夠。無論再怎么小心，細胞在冷凍和復蘇過程中總會死掉一批的。所以，一開始凍存細胞的數(shù)量要足夠。一般要達到5× 10^6 /毫升，一瓶不夠兩瓶湊。但是，這個不能一概而論。有些細胞，比如雜交瘤細胞，只需要1-3x 10^6 /毫升

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