細胞凍存復(fù)蘇方法

1.  細胞實驗室進行常規(guī)消毒，紫外照射40min以上。

2.  培養(yǎng)液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱37°C預(yù)熱20min，備用。

3.  二亞砜（DMSO)在40°C冰箱中冷藏30min，備用。

4.  從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400°C水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。

5.  將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，凍存袋供應(yīng)商，離心（1000r/min，5min）。

6.  用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞，調(diào)整細胞濃度，方培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7.  記錄復(fù)蘇日期。

細胞凍存步驟

（1）將標(biāo)本編號，并用Marker筆仔細標(biāo)注于凍存管管蓋及管壁上，同時將每管編號、內(nèi)容物、取材日期記錄于登記本上。

（2）將凍存管裝入凍存袋，戴上棉線手套和防護面罩，迅速放入液氮罐中30～60秒速凍，200-074-401凍存袋供應(yīng)商，至凍存***完全凍住，取出待液氮完全揮發(fā)（注意動作輕柔，避免液氮濺灑）。

（3）將經(jīng)液氮速凍后的***放入-80℃冰箱相應(yīng)編號盒中，長期保存。

（4）取材完畢后，將剩余新鮮標(biāo)本浸泡于10%中爾馬林液中固定（切記不要拿錯病理號），做好和當(dāng)日冰凍值班醫(yī)生的交接，200-074-400凍存袋供應(yīng)商，避免遺漏。

（5）清洗取材臺及取材器具，器具需用消毒液完全浸泡10～15min，清水沖洗后擦干置于干燥處保存?zhèn)溆茫〔钠骶邞?yīng)定期高溫消毒。

凍存袋注意事項

1.欲冷凍保存之細胞應(yīng)在生長良好且存活率高之狀態(tài)，約為80~90%致密度。

冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有antibody之產(chǎn)生。

2.細胞在液氮中可長期凍存沒有時間限制，而不會影響細胞活力﹔在-70度可保存數(shù)月。注意冷凍保護劑之品質(zhì)。

DMSO應(yīng)為***級等級，無菌且無色是直接購買無菌產(chǎn)品，以5~10m1小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。

3.凍存細胞數(shù)量要足夠。無論再怎么小心，細胞在冷凍和復(fù)蘇過程中總會死掉一批的。所以，一開始凍存細胞的數(shù)量要足夠。一般要達到5× 10^6 /毫升，一瓶不夠兩瓶湊。但是，這個不能一概而論。有些細胞，比如雜交瘤細胞，只需要1-3x 10^6 /毫升

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