分子實驗介紹——熒光檢測

細胞熒光染色是以熒光物質(zhì)標記而進行抗原***的技術(shù)。在細胞中，通過特定的標記，重慶pcr，可以檢測目的蛋白表達量和表達***。是細胞中的可直觀觀察細胞內(nèi)蛋白***和表達的實驗方法。

實驗流程：細胞固定-細胞膜破膜-蛋白封閉-目的蛋白結(jié)合-熒光二抗結(jié)合-DAPI染色-熒光顯微鏡拍照或激光共聚焦顯微鏡拍照。

結(jié)果示例：

細胞熒光染

通過觀察細胞中蛋白的熒光強度和***分析該蛋白的表達變化。

20.Primer設(shè)計的基本原則是什么？

答：引物設(shè)計的下列原則供您參考。

◆引物長度一般在18-35mer。

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆避免近3"端有酶切位點或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

◆如果可能避免在3"端5個堿基有2個以上的G或C。

◆如果可能避免在3"端1個堿基為A。

◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。

◆退火溫度Tm控制在 58-60C 左右。

◆如果是設(shè)計點突變引物，突變點應盡可能在引物的中間。

21.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：引物應該全是DNA，但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會有蛋白質(zhì)污染？引***學合成，哪里有機會污染到蛋白質(zhì)？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。

單細胞測序（英語：Single cell sequencing）采取優(yōu)化的下一代DNA測序技術(shù)（NGS）檢測單細胞的序列，可以獲得特定微環(huán)境下的細胞序列差異以方便研究其功能差異等。對個體細胞的DNA測序可以幫助我們了解例如在中的小范圍細胞的變異；對其進行RNA測序可以幫助我們了解和鑒別不同的細胞類型與其表現(xiàn)的***，對研究發(fā)育生物學等有較大裨益。

分離單細胞

在全***組擴增和測序前，有很多方法可以分離細胞個體，***檢測怎么做，其中流式細胞術(shù)（FACS）較為常用。個體細胞可以用顯微操作來收集，這樣較為快捷而且成本較低，但是比較有技術(shù)難度，而且顯微鏡下對細胞的錯誤分類容易影響實驗結(jié)果。激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM）亦可以用來收集單細胞。但是盡管激光捕獲顯微切割可以保留樣本細胞在***中的空間位置，PCR，但是捕獲單細胞的時候容易連帶周圍細胞的物質(zhì)。高通量的細胞個體分離還可以使用微流控技術(shù)。微流控技術(shù)和流式細胞技術(shù)都能準確而自動地分離無偏樣本。但是，兩種方法都要求首先將細胞從其為環(huán)境中脫離，因此可能在RNA表達分析中造成對轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的干擾。