脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

1、細(xì)胞H9C2 (Hela) 6孔板Hela1x10°/孔。

2、轉(zhuǎn)染前換上沒(méi)有抗sheng素的DMEM+胎清(10%)。

3、將質(zhì)粒DNA (約2-4ul) 2ul 加入dorf管中+DMEM至50u1。

4、脂質(zhì)體5ul補(bǔ)培養(yǎng)基至50ul混勻靜止5分鐘(質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例為1:2或1.5:2.5)。

5、將含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基與含質(zhì)粒的混合總體積100ul室溫放置30分鐘。

6、吸取混合物均勻加入每一個(gè)孔中。

7、將6孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)后吸出培養(yǎng)基換上新配置的培養(yǎng)基DMEM6ml+胎清600u1+三抗300u1。

8、培養(yǎng)24小時(shí)。

軟瓊脂培養(yǎng)克l隆形成試驗(yàn)基本步驟:

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活l細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血l清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1x106細(xì)胞/L。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋。

(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會(huì)凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2xDMEM培養(yǎng)基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2xDMEM培養(yǎng)基在無(wú)菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包哪家好，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37回5%CO2溫箱中培養(yǎng)10~14天。

(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞數(shù)。計(jì)算形成率。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測(cè)腫l瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí)，瓊脂溫度不宜超過(guò)40日。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過(guò)35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克l隆形成試驗(yàn)。

軟瓊脂集落形成率實(shí)驗(yàn)(軟瓊脂克l隆)

將1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2x細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包公司，6孔板中每個(gè)孔1.4ml溫室凝固，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞濃度為10000個(gè)/ml，將0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2x細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul單細(xì)胞懸液(約1000ell/wel)， 混勻，室溫凝固。置于37目，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上得克l隆，計(jì)算細(xì)胞集落形成率，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包選哪家，Spotll 采集圖像。

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的常見(jiàn)問(wèn)題

Q：培養(yǎng)液到底要不要加雙抗（青&鏈）？

A：雙抗不是細(xì)胞生長(zhǎng)必需的。我們培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)不常規(guī)使用，因?yàn)檫B續(xù)使用會(huì)促進(jìn)耐藥性細(xì)胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將從培養(yǎng)液中去除，這種輕度污染終將發(fā)展成為大規(guī)模污染。具體情況，可根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，自行決定是否使用雙抗。

Q：細(xì)胞培養(yǎng)，上海細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，能更換成其它種類的培養(yǎng)基嗎？

A：我們強(qiáng)烈建議好使用細(xì)胞提供機(jī)構(gòu)或細(xì)胞庫(kù)推薦的生長(zhǎng)培養(yǎng)液。有些細(xì)胞可能會(huì)適應(yīng)在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在做好保種的條件下，可以分出部分細(xì)胞做測(cè)試。

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