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考馬斯亮藍g-250染色法測定蛋白質含量與其他方法相比有什么優(yōu)缺點
蛋白質的存在影響酸堿滴定中所用某些指示劑的顏色變化,從而改變這些染料的光吸收。在些基礎上發(fā)展了蛋白質染色測定方法。涉及的指示劑有甲ji橙、考馬斯亮藍、xiu甲fen綠和xiu jia酚紫。目前廣泛使用的染料是考馬斯亮藍。
考馬斯亮藍G-250在酸性溶液中為棕紅色,當它與蛋白質通過范德華鍵結合后,變?yōu)樗{色,且在蛋白質一定濃度范圍內符合比爾定律,可在595nm處比色測定。2—5分鐘即呈da光吸收,至少穩(wěn)定1小時。在0.01—1.0 mg蛋白質/ml范圍內均可。該法操作簡便迅速,消耗樣品量少,但不同蛋白質之間差異大,玻璃水亮藍批發(fā),且標準曲線線性差。高濃度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、bing酮、***銨和去污劑時測定有干擾。緩沖液濃度過高時,改變測定液pH值會影響顯色??捡R斯亮藍染色能力強,比色杯不洗干凈會影響光吸收值,不可用石英懷測定


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考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程:
該方法用于大多數(shù)蛋白質的定量是比較精que的,但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0.2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1.Bradford濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml 95%乙醇,酒泉玻璃水亮藍,加入100ml85%的磷酸,然后,用蒸餾水補充至1000ml,此染液放4℃至少6個月保持穩(wěn)定。
2.標準曲線蛋白質樣本的準備:盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品,例如測定抗ti,玻璃水亮藍供應商,可用純化的抗ti作為標準。如果待測樣本是未知的,也可用抗ti作為標準蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標準曲線。
3.將待測樣本溶于緩沖溶液中,該緩沖溶液應與制作標準曲線的緩沖溶液相同(hao用PBS)。
4.按1:5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液,如出現(xiàn)沉淀,過濾除去。
5.每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液,作用5~30min。染液與蛋白質結合后,將由紅色變?yōu)樗{色,在595nm波長下測定其吸光度。注意,顯色反應不得超過30min.
6.根據(jù)標準曲線計算待測樣本的濃度。


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