1、細胞準(zhǔn)備：細胞傳到后，成都pcr，密度達到70％左右時進行轉(zhuǎn)染；
2、細胞轉(zhuǎn)染:取兩個EP管，一個加入Opti-MEM、質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒；另一個加入Opti-MEM、lipo2000，然后將兩管混勻；
3、細胞孵育：將混合液逐滴加入細胞培養(yǎng)皿中，混勻后孵育；
4、收集病毒：轉(zhuǎn)染后48h、72h收集含慢病毒的上清；
5、滴度檢測:細胞為30%－50％時加入病毒上清液，檢測陽性細胞比例。
microRNA芯片:
RNA干擾(RNA Interference， RNAi)現(xiàn)象是一種進化上保守的抵御或外來病毒qin犯的防御機制。將含有靶***mRNA同源互補序列的RNA（Double strand RNA， dsRNA）導(dǎo)入細胞后，能夠特異地識別該mRNA，引起mRNA的降解，從而導(dǎo)致相應(yīng)的功能缺失。RNAi提供了一種經(jīng)濟、快捷、gao效的***特異***表達的技術(shù)手段，該技術(shù)已被廣泛用于研究***功能和chuan染性***及惡xingzhong瘤***zhi療領(lǐng)域。目前常用的RNA干擾手段為miRNA、 shRNA和siRNA等。
MiRNA是一類可以通過RNAi機制調(diào)節(jié)***表達的內(nèi)源性小RNA，實時定量pcr，人工miRNA與shRNA的設(shè)計原理基本相同，由于miRNA具有內(nèi)源性，因此其更易產(chǎn)生有效的***沉默。
技術(shù)流程：
dsRNA或pre-miRNA被導(dǎo)入細胞后，***檢測怎么做，能夠被一種特異的核酸內(nèi)切酶（Dicer）識別并切割成為小片段，這些片段在RNA解旋酶的作用下解鏈。繼之反義鏈在與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-Induced Silencing Complex，RISC），RISC與mRNA同源區(qū)進行特異性結(jié)合，若miRNA與mRNA的結(jié)合位點配對，則切割mRNA；若miRNA與mRNA的結(jié)合位點不配對，則***mRNA的翻譯。
25.PCR擴增不出就引物有問題嗎？
答：基本不是。當(dāng)今發(fā)展出各色各樣的PCR擴增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決PCR擴增中遇到的擴不出、擴增效率低的問題。如巢式PCR就是擴增那些拷貝數(shù)很低的***片段。 有些重復(fù)片段的擴增， GC含量高的片段，非要采用特殊擴增手段才能擴增出了。
引物擴增不出，主要是下列兩種情況比較常見：
（1） RT-PCR。請注意，很多***通過常規(guī)RT -PCR方法是很難擴增出來的。 RT- PCR成功的關(guān)鍵在于RT的反應(yīng)的RNA質(zhì)量和目標(biāo)***在特定***和細胞中含量。
（2）從***組中擴增。一般情況下，dna檢測，***在***組中都是單拷貝，***組作為模板需要嚴(yán)格控制用量。***組DNA過高，會影響反應(yīng)體系中的Mg和pH
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