***組甲l基化水平(Methyl ati on Content)的分析:
1.高l效液相色譜(Hi gh-performanceLi qui dChromatography， HPLC)HPLC是- -種比較傳統(tǒng)的方法，寧夏pcr，是根據(jù)DNA或蛋白分子量和構(gòu)象的不同而使其加以分離。由于在動(dòng)態(tài)相和靜態(tài)相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。隨著系統(tǒng)的壓強(qiáng)的增加，其分辨率增l高。故而能夠定量測(cè)定***組整體水平DNA甲l基化水平。該方法由Ruo等1980年首l次報(bào)道。過(guò)程是將DNA樣品先經(jīng)鹽酸或氫l氟酸水解成堿基，水解產(chǎn)物通過(guò)色譜柱，fish檢測(cè)，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比較，用紫外光測(cè)定吸收峰值及其量，計(jì)算5 mC/(5mC+5C)的積分面積就得到***組整體的甲l基化水平。這是一種檢測(cè)DNA甲l基化水平的標(biāo)準(zhǔn)方法。
2.高l效毛細(xì)管電泳法(Hi gh-per formance Capillary Electrophoresis， HPCE)這是一-種利用窄孔熔融石英毛細(xì)管來(lái)從復(fù)合物中分離不同化學(xué)組分的技術(shù)。其基礎(chǔ)是在強(qiáng)電場(chǎng)下不同分子的由于其所帶電荷，大小，熒光定量pcr，結(jié)構(gòu)以及疏水性等不同而相互分開(kāi)。用HIPCE方法處理DNA水解產(chǎn)物來(lái)確定5mC水平，簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)且敏***高。
通?；钚匝蹶?yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細(xì)胞后裝載探針：按照1：1000用無(wú)培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬(wàn)至二千萬(wàn)/毫升，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽(yáng)性對(duì)照及自己感興趣的刺激細(xì)胞，pcr檢測(cè)，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通常活性氧陽(yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
2.、檢測(cè)
對(duì)于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀(guān)察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用激光共聚焦顯微鏡直接觀(guān)察也可以。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
操作步驟
1.在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
1QPCR buffer
5 μl
dNTP mix( 2mM )
4 μl
引物1(10pM)
μl 2
引物2 ( 10pM)
2μl
Taq酶(2U/ul)
1 μl
DNA模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddH2O至
μl 50
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上執(zhí)行擴(kuò)增。-般:在93°C
預(yù)變性3-5min ，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ，循環(huán)30-35
次，后在72°C保溫7min。
3.結(jié)束反應(yīng)， PCR產(chǎn)物放置于4°C待電泳檢測(cè)或-20°C長(zhǎng)期保存。
4. PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100ul進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以
除去石蠟油;否則，直接取5- 10μl電泳檢測(cè)。
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