3D細(xì)胞培養(yǎng)

3D多細(xì)胞腫liu球是在體外應(yīng)用***培養(yǎng)方法使腫liu細(xì)胞以多細(xì)胞集聚體的形式生長(zhǎng)成為具有三維結(jié)構(gòu)的球體。與傳統(tǒng)的2D貼壁細(xì)胞培養(yǎng)模型相比，3D多細(xì)胞腫liu球可以通過模擬三維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，從而更加貼近腫liu***中相應(yīng)的病理生理特征。因此， 3D多細(xì)胞腫liu球培養(yǎng)模型已經(jīng)逐漸應(yīng)用于gan細(xì)胞培養(yǎng)和分化、ai癥研究、yao物和毒性篩選及***工程等特定應(yīng)用中。雖然3D多細(xì)胞腫liu球模型具有更顯著的實(shí)體腫liu生理相關(guān)性，但是與2D貼壁細(xì)胞培養(yǎng)模型相比，獲得大量相對(duì)統(tǒng)一的3D多細(xì)胞腫liu球模型需要-系列的培養(yǎng)過程和表征手段。

Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測(cè)試劑。WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧ji-4-硝ji苯j(luò)i)-3-(4-硝ji苯j(luò)i)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，是一種類似于MTT的化合物，它在電子載體1-甲氧ji-5-甲ji吩嗪鎓***二jia酯（1-Methoxy PMS）存在的情況下，被線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙***甲瓚產(chǎn)物（formazan）。細(xì)胞增殖越多越快，顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺，對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺與活xi胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

 細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)    

     1．培養(yǎng)板的預(yù)處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細(xì)胞懸液：將待測(cè)已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號(hào)zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細(xì)胞，浙江細(xì)胞，用毛細(xì)吸管輕輕吹散細(xì)胞團(tuán)后，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，將懸液通過250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，計(jì)數(shù)細(xì)胞后，用1640液重新懸浮細(xì)胞，配成所需濃度；

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細(xì)胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過氧化物酶結(jié)合的親合素（***i-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計(jì)數(shù)所顯示出的顏色的斑點(diǎn)。

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