單細(xì)胞RNA測(cè)序

單細(xì)胞RNA測(cè)序也稱scRNA-Seq。通常而言，一般的***細(xì)胞RNA-seq實(shí)驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生1000萬(wàn)個(gè)讀數(shù)，dna檢測(cè)，如果一個(gè)***的頻率超過(guò)50RPKM，即每百萬(wàn)讀數(shù)中每千個(gè)堿基中超過(guò)50個(gè)，pcr引物設(shè)計(jì)，這一***即被認(rèn)為有表達(dá)。泊松分布下，1kb長(zhǎng)的***有超過(guò)500個(gè)讀數(shù)和4%的小變異系數(shù)，即CV值；哺乳動(dòng)物細(xì)胞通產(chǎn)含有200，000個(gè)mRNA，因此至少要用50個(gè)單細(xì)胞一起才能到達(dá)小CV值；考慮到逆轉(zhuǎn)錄的效率和環(huán)境干擾等因素，為得到準(zhǔn)確的表達(dá)和細(xì)胞種類的識(shí)別，需要使用的細(xì)胞數(shù)量實(shí)際要更多。

3、參數(shù)設(shè)置

使用488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)DCF。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。

4、其它說(shuō)明

陽(yáng)性對(duì)照可以按照1：1000的比例使用。例如裝載好探針的細(xì)胞共1毫升，可以加入1微升的陽(yáng)性對(duì)照刺激。通常刺激后20-30分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對(duì)于不同的細(xì)胞，活性氧陽(yáng)性對(duì)照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當(dāng)提高活性氧陽(yáng)性對(duì)照的濃度。如果活性氧升高得過(guò)快，可以適當(dāng)降低活性氧陽(yáng)性對(duì)照的濃度。

另外，對(duì)于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒(méi)有刺激的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1：2000-1：5000稀釋DCFH-DA，pcr，使裝載探針時(shí)DCFH-DA的濃度為2-5微摩爾/升。探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。

甲l基化特異性的PCR

Herman 等（ 1996 ）在使用重亞***鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。該方法敏***高，主要用于作定性研究。用亞***氫鹽處理***組DNA，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧定被轉(zhuǎn)化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)jia基化和非jia基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過(guò)電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后jia基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說(shuō)明該位點(diǎn)存在jia基化；反之，說(shuō)明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在jia基化。

特點(diǎn)：適用范圍廣，能夠檢測(cè)特異位點(diǎn)是否發(fā)生jia基化。

亞***氫鹽測(cè)序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

亞***氫鹽修飾后測(cè)序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA jia基化方法，此方法可靠性及jing確度高，能明確目的片段中每一個(gè) CpG 位點(diǎn)的jia基化狀態(tài)。用亞***氫鹽處理***組DNA，PCR，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧ding被轉(zhuǎn)化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過(guò)程中尿嘧定全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧定，***后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生jia基化，稱為BSP-直接測(cè)序法。將PCR產(chǎn)物克long至載體后進(jìn)行測(cè)序，可以提高測(cè)序成功率，這種方法稱為BSP-ke隆測(cè)序法。

特點(diǎn)：jing確度高，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出jia基化的程度百分比。