分子實(shí)驗(yàn)介紹——印跡（Western blot）檢測(cè)

通過(guò)SDS-PAGE凝膠將細(xì)胞或生物樣品內(nèi)的蛋白按照蛋白分子量從大到小規(guī)律分離開(kāi)。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如纖維素薄膜或PVDF膜）上，pcr引物設(shè)計(jì)，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的起反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二起反應(yīng)（目前主要用HRP標(biāo)記的第二），經(jīng)過(guò)底物顯色或自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的***表達(dá)的蛋白成分（目前主要使用魯米諾和二抗中的HRP反應(yīng)發(fā)出熒光，通過(guò)儀器或者膠片顯色）。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)流程：細(xì)胞收集-細(xì)胞裂解，蛋白提取-蛋白變性-SDS-PAGE電泳-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜印記-蛋白封閉-目的孵育-二抗孵育-顯色拍照

結(jié)果示例：

圖 A不同大小的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)圖片；B A蛋白不同培養(yǎng)時(shí)間后Western blot檢測(cè)圖片；C 使用Image pro plus軟件對(duì)A蛋白灰度檢測(cè)，A蛋白表達(dá)變化統(tǒng)計(jì)圖

RNA提取處理的步驟如下：

在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二焦碳酸酯為活性很強(qiáng)的物，須在通風(fēng)櫥中小心使用）

將待處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，pcr，在通風(fēng)柜中37℃ 或室溫下處理過(guò)夜。

將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC- H2O 處理過(guò)的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用。

玻璃和金屬物品250 ℃烘烤3小時(shí)以上。

RNA pull down 檢測(cè)

RNA   pull down：RNA沉淀檢測(cè)，dna檢測(cè)，是檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)方法之一。使用體外轉(zhuǎn)錄將RNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，***檢測(cè)多少錢，并與細(xì)胞蛋白裂解液孵育，形成RNA-蛋白復(fù)合物。復(fù)合物通過(guò)磁珠結(jié)合后分離，復(fù)合物純化洗脫后通過(guò)Western blot驗(yàn)證檢測(cè)特性的蛋白。若篩選可能結(jié)合的蛋白通過(guò)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)篩選。

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