重組腺病毒-慢病毒構(gòu)建包裝服務(wù)
為促進(jìn)國(guó)內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，RealGene從2008年開始，對(duì)國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室開展重組腺病毒/慢病毒構(gòu)建、包裝及擴(kuò)增服務(wù)，可以由客戶提供自己的
***，完成腺病毒/慢病毒構(gòu)建、鑒定、包裝的服務(wù)。
一、技術(shù)路線：
（一）A、腺病毒載體構(gòu)建：
本系統(tǒng)是以Ad5***型E1/E3缺陷型腺病毒DNA為骨架，在***、包裝、擴(kuò)增等各部條件做了改進(jìn)和優(yōu)化，達(dá)到了***陽(yáng)性率更高、質(zhì)量更可靠、
包裝穩(wěn)定、出毒迅速、滴度高等效果。在此基礎(chǔ)上，還拓展了更廣泛的應(yīng)用，可以提供各種帶報(bào)告***的，帶不同標(biāo)簽的腺病毒構(gòu)建和包裝服務(wù)。
所包裝的腺病毒已成功應(yīng)用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，***轉(zhuǎn)位，Co-IP，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，***研究等科研實(shí)驗(yàn)。并且可以完成較高難度的***構(gòu)建，包括具有
細(xì)胞毒性作用***的腺病毒構(gòu)建，在短時(shí)間內(nèi)完成從原始質(zhì)粒到病毒DNA的構(gòu)建工作。 

• ***目的***到穿梭載體（中介載體）及鑒定

根據(jù)客戶提供的原始質(zhì)粒信息確定***方案：

• 如果原始質(zhì)粒與本系統(tǒng)所用穿梭載體有匹配酶切位點(diǎn)，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片斷，回收并連接到穿梭載體。酶切，測(cè)序鑒定；
• 如果原始質(zhì)粒與本系統(tǒng)所用穿梭載體沒(méi)有匹配酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)帶有特殊接頭的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片斷，采用相應(yīng)的內(nèi)
  切酶切下相應(yīng)片斷，回收并連接到穿梭載體。酶切，測(cè)序鑒定；
• 對(duì)于不適用于以上方案或者有特定要求的樣品，與客戶協(xié)商定制具體實(shí)施方案

2）***目的***到腺病毒載體pAdPL及鑒定
利用重組技術(shù)將目的片段的表達(dá)框從穿梭載體轉(zhuǎn)移到腺病毒載體。
酶切鑒定陽(yáng)性***，將陽(yáng)性***測(cè)序二次鑒定。
B、慢病毒載體構(gòu)建
慢病毒（Lent virus）載體是以HIV-1（人類***缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的******載體，該載體可以將外源***有效地整合到宿主染色體
上，達(dá)到持久性表達(dá)的效果?？捎行У?*****元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、***細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、***等多種類型的細(xì)胞，效果非常理想，
因此具有廣闊的應(yīng)用前景。
（二）病毒包裝、擴(kuò)增：

• 將鑒定正確的******到慢病毒載體，與輔助載體一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行包裝；
• 將包裝好的病毒***離心收集；
• 將濃縮病毒進(jìn)行滴定，滴定結(jié)果單位為PFU/ml（一般為5×108 PFU/ml以上，體積為500μl以上，根據(jù)客戶需要，不同量有價(jià)格差異）

二、質(zhì)量控制與鑒定：

• 測(cè)序鑒定
• 根據(jù)特定引物作RT-PCR鑒定
• 蛋白表達(dá)鑒定（根據(jù)客戶要求并由客戶提供高特異性***）

三、客戶須知：
對(duì)于客戶所要構(gòu)建腺病毒的目的***，客戶須提供詳細(xì)的***相關(guān)信息，包括***序列，載體序列，載體圖譜。
載體構(gòu)建步驟所需時(shí)間，根據(jù)不同構(gòu)建方案，需15到25個(gè)工作日。
從合同簽訂之日起，客戶需交納首期技術(shù)服務(wù)費(fèi)（50%服務(wù)費(fèi)），方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。服務(wù)結(jié)束時(shí)一次結(jié)清余款。
客戶需提供的信息及材料：

• 插入目的片段序列信息，原始載體序列信息，載體圖譜，酶切分析圖等。
• 鑒定正確的原始質(zhì)粒，PCR引物及PCR鑒定方法說(shuō)明（包括PCR體系及PCR條件）（非必需，或需協(xié)商），測(cè)序引物（非必需，或需協(xié)
  商）。
• 原始質(zhì)粒的酶切鑒定報(bào)告、測(cè)序報(bào)告，如果客戶確定***的信息無(wú)誤，這條非必需。
• 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、要求，目?**有無(wú)細(xì)胞毒性，是否需要構(gòu)建對(duì)照病毒？
• 實(shí)驗(yàn)要求包括：是否自行構(gòu)建腺病毒載體？是否要求更換啟動(dòng)子、polyA等***元件？
• 實(shí)驗(yàn)?zāi)康陌ǎ河糜诩?xì)胞實(shí)驗(yàn)還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，需要***的細(xì)胞類型或動(dòng)物模型類型。

四、我們的承諾：

• 構(gòu)建腺病毒/慢病毒載體的時(shí)間約15到25個(gè)工作日。病毒的包裝，擴(kuò)增的時(shí)間約20到30個(gè)工作日?？傆?jì)需要45-55個(gè)工作日。
• 提供重組穿梭載體或者siRNA載體，重組腺病毒載體的酶切及測(cè)序報(bào)告。
• 免費(fèi)提供一管陰性對(duì)照（僅限通用型的，如果客戶指定的序列，需要另外計(jì)費(fèi)）。
• ***大插入片段5kb－8Kb。

補(bǔ)充說(shuō)明：

• 如果客戶需更換啟動(dòng)子，需保證所插入的***的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞***害作用，
• 如果插入的目的片段太長(zhǎng)，客戶要求測(cè)序驗(yàn)證全長(zhǎng)，需要提供***的特異引物，以測(cè)得全長(zhǎng)，加收一定的費(fèi)用。

五、腺病毒和慢病毒比較表 

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