激光共焦顯微鏡結(jié)構(gòu):
激光共聚焦掃描顯微鏡用激光作掃描光源,逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像,掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡,物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn),也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦,掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí),就可以獲得樣品不同深度層次的圖像,這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi),通過計(jì)算機(jī)分析和模擬,就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。
在結(jié)構(gòu) [4] 配置上,激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造外,還包括激光光源、掃描裝置、檢測(cè)器、計(jì)算機(jī)系統(tǒng) (包括數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換、應(yīng)用軟件)、圖像輸出設(shè)備、光學(xué)裝置和共聚焦系統(tǒng)等部分 [2]。由于該儀器具有高分辨率、高靈敏度、“光學(xué)切片”(Optical sectioning)、三維重建、動(dòng)態(tài)分析等優(yōu)點(diǎn),因而為基礎(chǔ)***與******的研究提供了有效手段。此外,cl*** 對(duì)熒光樣品的觀察具有明顯的優(yōu)勢(shì),只要能用熒光探針進(jìn)行標(biāo)記的樣品就可用其觀察。
激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài),也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測(cè)量, 配合焦點(diǎn)穩(wěn)定系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間***動(dòng)態(tài)觀察。
激光共聚焦顯微鏡原理:
在普通寬視野光學(xué)顯微鏡中,整個(gè)標(biāo)本全部都被***弧光燈或氙燈的光線照明,圖像可以用肉眼直接觀察。 同時(shí),來(lái)自焦點(diǎn)以外的其他區(qū)域的熒光對(duì)結(jié)構(gòu)的干擾較大,尤其是標(biāo)本的厚度在 2um 以上時(shí),其影響更為明顯。
激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場(chǎng)光源和局部平面成像模式,采用激光束作光源,激光束經(jīng)照明***,經(jīng)由分光鏡反射至物鏡,并聚焦于樣品上,對(duì)標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。 ***樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì),受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來(lái)入射光路直接反向回到分光鏡,通過探測(cè)***時(shí)先聚焦,聚焦后的光被光電倍增管(PMT)探測(cè)收集,并將信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī),處理后在計(jì)算機(jī)顯示器上顯示圖像。 在這個(gè)光路中,只有在焦平面的光才能穿過探測(cè)***,焦平面以外區(qū)域射來(lái)的光線在探測(cè)小孔平面是離焦的,不能通過小孔。因此,非觀察點(diǎn)的背景呈黑色,反差增加,成像清晰。由于照明***與探測(cè)***相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的,焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明***與探測(cè)***,焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)***處成像,即共聚焦。 以激光作光源并對(duì)樣品進(jìn)行掃描,在此過程中兩次聚焦,故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。
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